PLC/PRF/5人肝癌亚力山大细胞

PLC/PRF/5人肝癌亚力山大细胞（简称 PLC/PRF/5 细胞）是源自人类原发性肝细胞癌的贴壁生长细胞系，因携带乙型肝炎病毒（HBV）基因组整合片段，且稳定保留肝癌细胞的恶性生物学特征，成为研究 HBV 相关肝癌发病机制、病毒 - 宿主相互作用及肝癌药物筛选的重要体外模型，为肝癌基础研究与临床转化提供关键实验载体。

一、核心生物学特性

（一）来源与病毒关联特性

PLC/PRF/5 细胞分离自肝癌患者手术切除的肿瘤组织，经体外传代建系后，其基因组中稳定整合 HBV DNA 片段（主要为 HBV 核心抗原基因与表面抗原基因），可持续表达 HBV 相关抗原（如 HBsAg、HBeAg），但不产生完整感染性病毒颗粒，既模拟 HBV 感染相关肝癌的分子背景，又降低生物安全风险，是研究 HBV 致肝癌机制的理想模型。

（二）形态与增殖特征

细胞形态呈多边形或不规则梭形，贴壁生长时呈 “铺路石" 样排列，但细胞间隙较正常肝细胞大，部分细胞可见胞质空泡（提示肝细胞代谢异常）；细胞核大且多呈异形，核仁明显，染色质分布不均，偶见多核细胞，符合肝癌细胞的恶性形态表现。增殖能力强，倍增时间约 28-34 小时，对数生长期增殖速度显著高于正常肝细胞，无接触抑制现象，细胞密度过高时可堆叠生长，传代 50 代以上仍能维持稳定的增殖特性与病毒相关表型。

（三）功能与分子特征

除肝癌细胞通用恶性特征外，PLC/PRF/5 细胞具独特功能属性：可分泌甲胎蛋白（AFP，阳性率较高）、γ- 谷氨酰转肽酶（GGT）等肝癌标志物，同时持续表达 HBV 抗原，可通过 ELISA 或免疫荧光检测，为 HBV 相关肝癌的表型研究提供依据；分子层面存在肝癌常见的基因异常，如 p53 基因突变、PI3K/AKT 信号通路激活，且 HBV 整合片段可影响宿主癌基因（如 MYC）表达，进一步贴近临床 HBV 相关肝癌的分子病理特征。

二、体外培养关键条件

（一）培养基与环境控制

基础培养基选择以 DMEM（高糖）为主，需添加 10%-12% 胎牛血清（需筛选低内毒素批次，避免影响细胞 HBV 抗原表达），满足细胞快速增殖对营养的需求，同时加入 1% 无菌防护试剂预防细菌污染。培养基 pH 需控制在 7.2-7.4，渗透压维持在 280-320mOsm/kg，可通过添加 10mM HEPES 缓冲液增强 pH 稳定性，避免环境波动影响细胞活性与 HBV 抗原表达。

培养环境需严格维持 37℃、5% CO?、95% 湿度的恒温恒湿条件，CO?浓度波动需控制在 ±0.5%，防止 pH 剧烈变化导致细胞形态异?；蚩乖泶锵陆?。

（二）传代与维护操作

因细胞贴壁生长且增殖较快，传代周期约 2-3 天，当细胞汇合度达 80%-85% 时需及时传代：先用消化液（37℃孵育 1-2 分钟）处理，待细胞边缘收缩、脱离培养瓶壁时，加入含血清的培养基终止消化，轻轻吹打制成单细胞悬液，按 1:4-1:6 比例接种至新培养瓶。每日需通过倒置显微镜观察细胞状态，若发现细胞空泡增多、形态变圆或培养基浑浊，需及时更换培养基或排查污染；若 HBV 抗原表达量下降，需检测血清质量或调整培养温度（严格维持 37℃）。

（三）冻存与复苏

细胞冻存时，使用含 10% 二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清作为冻存液，采用梯度降温法（4℃ 30 分钟→-20℃ 1 小时→-80℃过夜→液氮保存），减少冰晶形成对细胞的损伤；复苏时，将冻存管快速放入 37℃水浴中 1-2 分钟解冻，立即加入 5 倍体积新鲜培养基稀释，离心去除 DMSO 后接种培养，复苏存活率通?？纱?75% 以上，复苏后需通过免疫荧光验证 HBV 抗原表达，确保细胞特性稳定。

三、主要实验应用场景

（一）HBV 相关肝癌机制研究

PLC/PRF/5 细胞是该领域的核心模型：科研人员可通过干扰 HBV 整合片段相关基因（如 HBx 基因），观察细胞增殖、凋亡及癌基因表达变化，明确 HBV 蛋白对肝癌细胞恶性表型的调控作用；也可通过转录组测序，筛选 HBV 整合诱导的差异表达基因（如 IFN 信号通路相关基因），解析 HBV 致肝癌的分子通路，为 HBV 相关肝癌的早期干预提供靶点。

（二）肝癌药物筛选与敏感性测试

该细胞适用于 HBV 相关肝癌的药物研发：可将不同浓度的抗肝癌药物（如靶向 HBV 蛋白的抑制剂、hua疗药物）作用于细胞，通过 MTT 法检测细胞活力，计算半数抑制浓度（IC50），评估药物对 HBV 相关肝癌细胞的杀伤效果；也可构建药物耐药细胞株，研究耐药基因（如 ABCB1）的表达变化，探究 HBV 相关肝癌的耐药机制，为临床用药提供参考。此外，可通过检测药物对 HBV 抗原表达的影响，评估药物对病毒相关表型的调控作用。

（三）病毒 - 宿主相互作用研究

利用细胞携带 HBV 基因组的特性，可研究 HBV 与宿主细胞的相互作用：通过染色质免疫沉淀（ChIP）技术，分析 HBV 整合片段与宿主基因组的结合位点，明确病毒整合对宿主基因表达的影响；也可检测细胞对干扰素（IFN）等抗病du药物的反应，研究宿主免疫通路对 HBV 相关肝癌细胞的调控作用，为开发 “抗病毒 + 抗肝癌" 联合治疗策略提供实验基础。

四、实验应用注意事项

实验前需通过 ELISA 或 Western blot 验证细胞 HBV 抗原（HBsAg、HBeAg）与肝癌标志物（AFP）的表达，确保细胞特性稳定，避免传代超过 50 代导致病毒相关表型退化；不同批次胎牛血清对细胞 HBV 抗原表达影响较大，需通过预实验筛选适配血清并固定使用。

操作需严格无菌，PLC/PRF/5 细胞对支原体污染敏感，污染后易导致 HBV 抗原表达下降、增殖异常，每传代 3 次需通过 PCR 检测支原体，污染后需立即丢弃以防交叉感染；虽细胞不产生感染性 HBV 颗粒，但仍需在生物安全二级实验室操作，避免 HBV DNA 片段扩散。

结果解读需结合临床 HBV 相关肝癌特征，体外模型无法wan全模拟体内肝脏微环境（如免疫细胞浸润、血管生成），结论需结合动物移植瘤模型（如裸鼠荷瘤实验）或临床样本数据综合分析；同时需与非 HBV 相关肝癌细胞系（如 HepG2）对比，明确 HBV 相关肝癌的独特机制，避免结果片面。